20152016年12省市猪繁殖与呼吸综合征的分子流行病学调查-母猪母仪天下之猪
2015-2016年12省市猪繁殖与呼吸综合征的分子流行病学调查
徐晓杰，张乔亚，谈晨，白娟*，姜平
( 南京农业大学动物医学院/农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室，江苏南京210095)
摘要: 猪繁殖与呼吸综合征病毒( PRRSV 是猪的一种重要的病原，给全球养猪业造成重大的经济损失洼冢洋介。本研究采集2015－2016 年我国12 省市362 份临床发病猪肺脏病料用ＲT－PCＲ检测ＲＲＲSV，结果有191 份为阳性蒯大富，阳性率为52. 8%。34 个毒株OＲF5 基因测序结果表明，所有的毒株均属美洲型，分为4 个亚型，其中2 个毒株形成一个新的亚型Ⅳ; 6 个毒株与美国NADC30 株有高度同源性，形成了亚型Ⅲ。研究表明我国PＲＲSV毒株存在遗传多样性，为猪繁殖与呼吸综合征的防治提供了理论依据。
关键词: 猪繁殖与呼吸综合征病毒( PRRSV; OＲF5 基因; 亚型
猪繁殖与呼吸综合征病毒( PRRSV），是猪的一种重要的病原，给全球养猪业造成重大的经济损失，临床上主要是以母猪流产、早产、死胎和木乃伊胎等，仔猪和育肥猪发生呼吸道疾病为特征［1－3］。
PＲＲSV 属于动脉炎病毒属镜子超人 ，为单股正链ＲNA 病毒［4－6］。根据病毒血清交叉中和试验和病毒基因序列分析，PＲＲSV 分为欧洲型( 代表株为Lelystad 病毒，LV) 和美洲型( 代表株为VＲ 2332 株) ［1，7］。PＲＲSV基因组大小约15 kb，有至少10 个开放阅读框，其中OＲF1a 和OＲF1b 编码14 个非结构蛋白［8－13］，OＲF2－OＲF7 编码8 个结构蛋白［8］。OＲF5 是一个主要的膜蛋白，包含大约200 个氨基酸。它有氨基酸信号肽、糖基化位点和可以诱导中和抗体的抗原决定簇［14］。由于它的免疫学意义和多态性，OＲF5 已经用于分析PＲＲSV 基因的多样性［15］。
为了研究2015—2016 年我国PＲＲSV 毒株流行和进化特征，本试验收集来自12 省市不同猪场的362份临床肺样品进行检测，对其中的34 份PＲＲSV 阳性样品进行OＲF5 基因测序分析。
1 材料与方法
1. 1 样品的采集
采集2015—2016 年来自江苏、浙江、四川、安畜牧与兽医2017 年第49 卷第6 期·153·徽、山东、河北、河南、上海、广东、广西、福建、江西等地区的362 份临床发病猪肺脏样品，每个样品取部分进行组织匀浆，反复冻融3 次用来提取ＲNA。
1. 2 ＲNA 提取和ＲT－PCＲ
取反复冻融3 次的组织进行匀浆，离心取上清参照Trizol reagent 说明书进行操作提取总ＲNA，用DEPC 水溶解，－70℃保存。反转录体系( 10 μL 体系) : ＲNA 模板7 μL，5×buffer 2 μL，dNTP ( 10 mmol /μL ) 0. 5 μL，Oligo( dT) 0. 5 μL。反应条件: 70 ℃水浴5min，冰浴2min。瞬离5 s 后再加入MLV 酶0. 25 μL，42 ℃水浴1h，得到的cDNA 用于PCＲ扩增。PCＲ体系( 25 μL 体系) : OＲF5 上游引物( 5'ATGTTGGGGAAGTGCTTGACCGCGT 3') 1 μL，OＲF5下游引物( 5'CTAGAGACGACCCCATTGCTCCGCT3') 1 μL，2 ×Taq 酶12. 5 μL，cDNA2 μL，双蒸水8. 5 μL断板龟。反应循环参数: 95 ℃ 5 min; 95 ℃ 30 s，56℃ 30 s，72 ℃ 50 s，共35 个循环; 最后72 ℃ 5min。反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。
1. 3 PCＲ产物的回收纯化、克隆、测序
将上述OＲF5 基因扩增产物用PCＲ产物提纯试剂盒进行回收纯化后克隆入pMD19－T 载体，然后将质粒转入到大肠杆菌DH5α中，挑取阳性单菌落放入氨苄抗性LB 中进行扩增培养，进行菌液PCＲ，体系如1. 2 所述，崔景富选取菌液PCＲ结果为阳性的菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司进行序列测定。
1. 4 OＲF5 基因遗传进化分析
利用DNAstar 中的Meg Align 对12 株参考毒( 见表1) 以及34 株来自我国东南地区的PＲＲSV 毒株( 见表2) 的OＲF5 基因序列比对和同源性分析，利用MEGA6. 0 中的邻接法对OＲF5 基因进行遗传进化分析险象迭生 。
2 结果
2. 1 ＲT－PCＲ检测PＲＲSV
对2015 － 2016 年采自我国不同省市的362份PＲＲSV 疑似样品进行ＲT－PCＲ检测，检测出ＲＲＲSV阳性样品191 份，阳性率为52. 8%。
2. 2 OＲF5 基因PCＲ扩增和基因序列测定
以PＲＲSV 各分离株的ＲNA 为模版，经ＲT－PCＲ扩增出特异性条带流浪的迪潘 ，长度均为603 bp 的OＲF5 的基因，与预期结果一致。分别将各段回收产物克隆到pMD19－T 载体，PCＲ检测为阳性克隆。基因序列测·154· Animal Husbandry ＆ Veterinary Medicine 2017 Vol. 49 No. 6定OＲF5 长度为603 bp。
2. 3 OＲF5 基因序列分析
34 株PＲＲSV 毒株的OＲF5 基因分别与JXA1 株、VＲ2332 株和NADC30 株进行比较，结果( 见表2) ，其中26 株毒株OＲF5 基因核苷酸的同源性与JXA1 达到91%～ 99%，3 个毒株与VＲ2332 为91% ～ 99%，6个毒株与NADC30 达到94%～95%。
基因进化树分析结果( 图1) 。34 株PＲＲSV 毒株分为4 个基因亚型，其中2 个毒株与代表毒株VＲ2332 属于亚型Ⅱ，6 个毒株和MN184C 毒株属于亚型Ⅲ，2 个毒株属于亚型Ⅳ，其余毒株属于亚型Ⅰ。其中亚型Ⅱ的毒株分别来自广西和山东，亚型Ⅲ的毒株分别来自山东、浙江和河南，亚型Ⅳ的分别来自浙江和河北，亚型Ⅰ的毒株多个省份均有涉及。
3 讨论
PＲＲSV 引起母猪和公猪的繁殖问题，并引起各阶段猪的呼吸道问题［16－17］。我国首次记录暴发猪蓝耳病是在1995 年底，然后在之后的1996 年至2000年之间，分离到一些流行毒株［18］。2006 年，在NSP2区域有不连续缺失30 个氨基酸的高致病性PＲＲSV 在我国暴发，造成我国养猪业严重经济损失［2］。此后，许多不同遗传背景的高致病性PＲＲSV 毒株在我国被分离到。最近，据报道称类似于NADC30 的PＲＲSV毒株是由美洲毒株与我国高致病性毒株进行基因交换而产生的新毒株［19］。而有些高致病性蓝耳病毒株是由疫苗毒株JXA1－P80 基因突变而来［20］。同时，在一些报道中欧洲型毒株偶有存在。研究表明，同一基因型的分离毒株之间序列存在明显差异，特别是在基因组OＲF1a 的NSP1β和NSP2，OＲF3 和OＲF5 的变异性比较大。其中NSP2 是PＲＲSV 基因组中突变率最高的部分，同时耐缺失或插入的能力很高［21］。OＲF5 蛋白作为病毒粒子表面主要的囊膜蛋白之一，存在遗传多样性［22－24］。
本研究通过对2015－2016 年间收集自我国12 省市的362 份PＲＲSV 疑似样品进行ＲT－PCＲ检测，共检出PＲＲSV 阳性样品161 份，阳性率达52. 8%。34份PＲＲSV 阳性样品的OＲF5 基因序列分析结果显示，均为美洲型PＲＲSV。从遗传进化分析可知，我国美洲型PＲＲSV 分为4 个亚型，即以JXA1 等HP ‐PＲＲSV 为代表的亚型Ⅰ，以VＲ2332 等经典毒株为代表的亚型Ⅱ武状元铁桥三，以NADC30 等为代表的亚型Ⅲ，以及以ZJ1503和HB1506 这两个毒株组成的亚型Ⅳ。其中亚型Ⅱ的毒株分别来自广西和山东，亚型Ⅲ的毒株分别来自山东、浙江和河南，亚型Ⅳ的分别来自浙江和河北，亚型Ⅰ的毒株多个省份均有涉及。
34 个毒株分析结果显示：
26 株毒株与JXA1 等高致病性PＲＲSV ( HP －PRRSV 高度同源，在进化树中均位于亚型Ⅰ中，这些毒株很可能起源于早期JXA1 等HP－PＲＲSV 毒株;
GX1512 和SD1505 毒株与经典毒株高度同源，在进化树中位于经典毒株以VＲ2332 为代表的亚型Ⅱ中，提示我国猪群中依然存在不断进化的经典PＲＲSV。
SD1503、ZJ1501、HZ1503、SD1508、ZJ1507 和ZS15116 株毒株与国外NADC30、MN184C 等高度同源，在进化树中位于以美国NADC30、MN184C 等毒株为代表的亚型Ⅲ中;
ZJ1503、HB1506 这个2 个毒株在进化树中位于单独的亚型Ⅳ中，表明我国出现了新的PＲＲSV 变异毒株。
在之前的研究中，亚型Ⅲ和亚型Ⅳ中的毒株与经典HP－PＲＲSV 毒株JXA1 相比，可能抗原表位发生很大变化。抗原表位B ( PNE) 在病毒中和中起重要作用，其中H38L39 ( F /I) 氨基酸残基是最关的氨基酸。在亚型Ⅳ的毒株中，抗原表位B 中重要抗体结合位点的H38L39( F /I) 被Y38 S39 替代。同时嘀嗒小说网，在亚型IV的毒株中，位于102 的氨基酸残基与亚型Ⅰ不同，但它对血清中的中和抗体敏感性发挥重要作用，这些的改变可能导致对于PRRSV的免疫失败［25］。
由上可知，2015－2016 年我国PＲＲSV 流行毒株存在基因多样性，HP－PＲＲSV 依然是优势流行毒株，且在有经典毒株存在的同时又不断有新变异毒株的出现，这些新变异毒株的存在既有可能是跨地区传播的结果，也有可能与引种有关曲阳影都 ，临床发表情况与亚型种类没有一致性，与病毒毒力和临床混合感染有关，疫苗免疫对于新亚型毒株效果不理想。本研究为PＲＲS防控提供了理论基础。
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做围产期母猪问题专家
1、围产期的母猪邢台华夏医院，你养好了吗
2、围产期母猪的4大应激，你忽略了吗？
3、母猪产程过长（滞产），你解决了吗？
4、从美国一家猪场人员配置谈“产后母猪的疲劳管理”
5、母猪产后食欲问题，你管理好了吗？
6、母猪子宫内膜炎的根源在这儿
7、围产期母猪饲养管理宝典
8、溜溜顺作用机理
9、溜溜顺使用方案
10、产品差异化：如何开发380万吨空白围产期母猪饲料
11、围产期母猪饲料的功能设计
2015-2016年12省市猪繁殖与呼吸综合征的分子流行病学调查
徐晓杰，张乔亚，谈晨，白娟*，姜平
( 南京农业大学动物医学院/农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室，江苏南京210095)
摘要: 猪繁殖与呼吸综合征病毒( PRRSV 是猪的一种重要的病原，给全球养猪业造成重大的经济损失洼冢洋介。本研究采集2015－2016 年我国12 省市362 份临床发病猪肺脏病料用ＲT－PCＲ检测ＲＲＲSV，结果有191 份为阳性蒯大富，阳性率为52. 8%。34 个毒株OＲF5 基因测序结果表明，所有的毒株均属美洲型，分为4 个亚型，其中2 个毒株形成一个新的亚型Ⅳ; 6 个毒株与美国NADC30 株有高度同源性，形成了亚型Ⅲ。研究表明我国PＲＲSV毒株存在遗传多样性，为猪繁殖与呼吸综合征的防治提供了理论依据。
关键词: 猪繁殖与呼吸综合征病毒( PRRSV; OＲF5 基因; 亚型
猪繁殖与呼吸综合征病毒( PRRSV），是猪的一种重要的病原，给全球养猪业造成重大的经济损失，临床上主要是以母猪流产、早产、死胎和木乃伊胎等，仔猪和育肥猪发生呼吸道疾病为特征［1－3］。
PＲＲSV 属于动脉炎病毒属镜子超人 ，为单股正链ＲNA 病毒［4－6］。根据病毒血清交叉中和试验和病毒基因序列分析，PＲＲSV 分为欧洲型( 代表株为Lelystad 病毒，LV) 和美洲型( 代表株为VＲ 2332 株) ［1，7］。PＲＲSV基因组大小约15 kb，有至少10 个开放阅读框，其中OＲF1a 和OＲF1b 编码14 个非结构蛋白［8－13］，OＲF2－OＲF7 编码8 个结构蛋白［8］。OＲF5 是一个主要的膜蛋白，包含大约200 个氨基酸。它有氨基酸信号肽、糖基化位点和可以诱导中和抗体的抗原决定簇［14］。由于它的免疫学意义和多态性，OＲF5 已经用于分析PＲＲSV 基因的多样性［15］。
为了研究2015—2016 年我国PＲＲSV 毒株流行和进化特征，本试验收集来自12 省市不同猪场的362份临床肺样品进行检测，对其中的34 份PＲＲSV 阳性样品进行OＲF5 基因测序分析。
1 材料与方法
1. 1 样品的采集
采集2015—2016 年来自江苏、浙江、四川、安畜牧与兽医2017 年第49 卷第6 期·153·徽、山东、河北、河南、上海、广东、广西、福建、江西等地区的362 份临床发病猪肺脏样品，每个样品取部分进行组织匀浆，反复冻融3 次用来提取ＲNA。
1. 2 ＲNA 提取和ＲT－PCＲ
取反复冻融3 次的组织进行匀浆，离心取上清参照Trizol reagent 说明书进行操作提取总ＲNA，用DEPC 水溶解，－70℃保存。反转录体系( 10 μL 体系) : ＲNA 模板7 μL，5×buffer 2 μL，dNTP ( 10 mmol /μL ) 0. 5 μL，Oligo( dT) 0. 5 μL。反应条件: 70 ℃水浴5min，冰浴2min。瞬离5 s 后再加入MLV 酶0. 25 μL，42 ℃水浴1h，得到的cDNA 用于PCＲ扩增。PCＲ体系( 25 μL 体系) : OＲF5 上游引物( 5'ATGTTGGGGAAGTGCTTGACCGCGT 3') 1 μL，OＲF5下游引物( 5'CTAGAGACGACCCCATTGCTCCGCT3') 1 μL，2 ×Taq 酶12. 5 μL，cDNA2 μL，双蒸水8. 5 μL断板龟。反应循环参数: 95 ℃ 5 min; 95 ℃ 30 s，56℃ 30 s，72 ℃ 50 s，共35 个循环; 最后72 ℃ 5min。反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。
1. 3 PCＲ产物的回收纯化、克隆、测序
将上述OＲF5 基因扩增产物用PCＲ产物提纯试剂盒进行回收纯化后克隆入pMD19－T 载体，然后将质粒转入到大肠杆菌DH5α中，挑取阳性单菌落放入氨苄抗性LB 中进行扩增培养，进行菌液PCＲ，体系如1. 2 所述，崔景富选取菌液PCＲ结果为阳性的菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司进行序列测定。
1. 4 OＲF5 基因遗传进化分析
利用DNAstar 中的Meg Align 对12 株参考毒( 见表1) 以及34 株来自我国东南地区的PＲＲSV 毒株( 见表2) 的OＲF5 基因序列比对和同源性分析，利用MEGA6. 0 中的邻接法对OＲF5 基因进行遗传进化分析险象迭生 。
2 结果
2. 1 ＲT－PCＲ检测PＲＲSV
对2015 － 2016 年采自我国不同省市的362份PＲＲSV 疑似样品进行ＲT－PCＲ检测，检测出ＲＲＲSV阳性样品191 份，阳性率为52. 8%。
2. 2 OＲF5 基因PCＲ扩增和基因序列测定
以PＲＲSV 各分离株的ＲNA 为模版，经ＲT－PCＲ扩增出特异性条带流浪的迪潘 ，长度均为603 bp 的OＲF5 的基因，与预期结果一致。分别将各段回收产物克隆到pMD19－T 载体，PCＲ检测为阳性克隆。基因序列测·154· Animal Husbandry ＆ Veterinary Medicine 2017 Vol. 49 No. 6定OＲF5 长度为603 bp。
2. 3 OＲF5 基因序列分析
34 株PＲＲSV 毒株的OＲF5 基因分别与JXA1 株、VＲ2332 株和NADC30 株进行比较，结果( 见表2) ，其中26 株毒株OＲF5 基因核苷酸的同源性与JXA1 达到91%～ 99%，3 个毒株与VＲ2332 为91% ～ 99%，6个毒株与NADC30 达到94%～95%。
基因进化树分析结果( 图1) 。34 株PＲＲSV 毒株分为4 个基因亚型，其中2 个毒株与代表毒株VＲ2332 属于亚型Ⅱ，6 个毒株和MN184C 毒株属于亚型Ⅲ，2 个毒株属于亚型Ⅳ，其余毒株属于亚型Ⅰ。其中亚型Ⅱ的毒株分别来自广西和山东，亚型Ⅲ的毒株分别来自山东、浙江和河南，亚型Ⅳ的分别来自浙江和河北，亚型Ⅰ的毒株多个省份均有涉及。
3 讨论
PＲＲSV 引起母猪和公猪的繁殖问题，并引起各阶段猪的呼吸道问题［16－17］。我国首次记录暴发猪蓝耳病是在1995 年底，然后在之后的1996 年至2000年之间，分离到一些流行毒株［18］。2006 年，在NSP2区域有不连续缺失30 个氨基酸的高致病性PＲＲSV 在我国暴发，造成我国养猪业严重经济损失［2］。此后，许多不同遗传背景的高致病性PＲＲSV 毒株在我国被分离到。最近，据报道称类似于NADC30 的PＲＲSV毒株是由美洲毒株与我国高致病性毒株进行基因交换而产生的新毒株［19］。而有些高致病性蓝耳病毒株是由疫苗毒株JXA1－P80 基因突变而来［20］。同时，在一些报道中欧洲型毒株偶有存在。研究表明，同一基因型的分离毒株之间序列存在明显差异，特别是在基因组OＲF1a 的NSP1β和NSP2，OＲF3 和OＲF5 的变异性比较大。其中NSP2 是PＲＲSV 基因组中突变率最高的部分，同时耐缺失或插入的能力很高［21］。OＲF5 蛋白作为病毒粒子表面主要的囊膜蛋白之一，存在遗传多样性［22－24］。
本研究通过对2015－2016 年间收集自我国12 省市的362 份PＲＲSV 疑似样品进行ＲT－PCＲ检测，共检出PＲＲSV 阳性样品161 份，阳性率达52. 8%。34份PＲＲSV 阳性样品的OＲF5 基因序列分析结果显示，均为美洲型PＲＲSV。从遗传进化分析可知，我国美洲型PＲＲSV 分为4 个亚型，即以JXA1 等HP ‐PＲＲSV 为代表的亚型Ⅰ，以VＲ2332 等经典毒株为代表的亚型Ⅱ武状元铁桥三，以NADC30 等为代表的亚型Ⅲ，以及以ZJ1503和HB1506 这两个毒株组成的亚型Ⅳ。其中亚型Ⅱ的毒株分别来自广西和山东，亚型Ⅲ的毒株分别来自山东、浙江和河南，亚型Ⅳ的分别来自浙江和河北，亚型Ⅰ的毒株多个省份均有涉及。
34 个毒株分析结果显示：
26 株毒株与JXA1 等高致病性PＲＲSV ( HP －PRRSV 高度同源，在进化树中均位于亚型Ⅰ中，这些毒株很可能起源于早期JXA1 等HP－PＲＲSV 毒株;
GX1512 和SD1505 毒株与经典毒株高度同源，在进化树中位于经典毒株以VＲ2332 为代表的亚型Ⅱ中，提示我国猪群中依然存在不断进化的经典PＲＲSV。
SD1503、ZJ1501、HZ1503、SD1508、ZJ1507 和ZS15116 株毒株与国外NADC30、MN184C 等高度同源，在进化树中位于以美国NADC30、MN184C 等毒株为代表的亚型Ⅲ中;
ZJ1503、HB1506 这个2 个毒株在进化树中位于单独的亚型Ⅳ中，表明我国出现了新的PＲＲSV 变异毒株。
在之前的研究中，亚型Ⅲ和亚型Ⅳ中的毒株与经典HP－PＲＲSV 毒株JXA1 相比，可能抗原表位发生很大变化。抗原表位B ( PNE) 在病毒中和中起重要作用，其中H38L39 ( F /I) 氨基酸残基是最关的氨基酸。在亚型Ⅳ的毒株中，抗原表位B 中重要抗体结合位点的H38L39( F /I) 被Y38 S39 替代。同时嘀嗒小说网，在亚型IV的毒株中，位于102 的氨基酸残基与亚型Ⅰ不同，但它对血清中的中和抗体敏感性发挥重要作用，这些的改变可能导致对于PRRSV的免疫失败［25］。
由上可知，2015－2016 年我国PＲＲSV 流行毒株存在基因多样性，HP－PＲＲSV 依然是优势流行毒株，且在有经典毒株存在的同时又不断有新变异毒株的出现，这些新变异毒株的存在既有可能是跨地区传播的结果，也有可能与引种有关曲阳影都 ，临床发表情况与亚型种类没有一致性，与病毒毒力和临床混合感染有关，疫苗免疫对于新亚型毒株效果不理想。本研究为PＲＲS防控提供了理论基础。
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