2 例 【病例分享】XLH-遗传与疾病论坛
以下是由我们实验室帮助完成的佝偻病检测一例:
先证者 1
男，3岁4个月，发现“O型腿”2年。不伴骨痛。第一胎第一产、足月顺产出生，出生时身长、体重不详，出生时无窒息。母乳喂养，10月龄添加辅食，无偏食挑食。7月龄能独坐、10月龄独站、1岁2个月能独立行走何乾梁。
既往体健。患儿父母健康，否认近亲结婚，家族中无类似患者。
体格检查
身高82 cm(-4.34 SD)，体重11 kg，前额突出，无方颅，无鸡胸，无肋骨串珠，无郝氏沟，无手足镯，心肺腹部查体未见异常，“O型腿”、膝间距9 cm避水金睛兽 。
实验室检查
血钙正常，血磷1.04 mmol/L(参考值：1.3~2.1 mmol/L)，ALP 792.8 U/L(参考值：95~405 U/L)，25(OH)D3正常，PTH正常。血气分析无异常。下肢骨片(见图1)：双膝关节骨骺端稍膨大，临时钙化带模糊。肾脏B超无异常。
先证者 2
女，7岁4个月，发现“X型腿”伴双下肢间断性疼痛5年。第一胎第一产、足月顺产出生，出生身长、体重不详，出生时无产伤、无窒息。喂养史、生长发育史无特殊。
既往体健。患儿父母体健，否认近亲结婚，家族中无类似患者。
体格检查
身高111.2 cm(-2.61 SD)猎魔通缉令，体重22.5 kg，无方颅，无鸡胸，无郝氏沟，无肋串珠，无手足镯，心肺腹部查体未见明显异常，“X型腿”、踝间距12 cm。
实验室检查
血钙正常，血磷0.5 mmol/L(参考值：1.3~2.1 mmol/L)，ALP 428 U/L(参考值：95~405 U/L)，PTH 110 pg/mL(参考值：10~69 pg/mL)。
肾脏B超：双肾皮质回声稍增强，双侧肾椎体见少许钙质成分沉着。
基因分析及家系分析
通过重庆医科大学附属儿童医院伦理审查及患儿家属知情同意后，采集患儿及其父母空腹EDTA抗凝静脉血各2 mL，提取基因组DNA。DNA浓度>10 ng/μL，体积>100 μL；纯度应达到A260/280>1.8，A260/230>1.2。
取先证者基因组，对PHEX基因的外显子区及两侧的剪接位点序列进行高通量测序，并利用PCR-Sanger测序对先证者及家系进行突变验证和分析(中国人民解放军空军医学研究所附属医院病理检验中心完成)。
引物设计根据GeneBank人类PHEX基因序列(NG_007563.2)，见表1。
PCR扩增，取PCR样品用ABI遗传分析仪进行测序。阳性突变者用另一份备用样品进行复测。
基因分析结果
经高通量捕获测序，发现先证者1在PHEX基因第14号内含子剪切位点发生单碱基置换：IVS14+1G>A；运用PCR-Sanger测序进行突变验证及家系分析克亚树，证实患儿父母该基因位点正常(图2)。
先证者2的PHEX基因检测到1个杂合突变：位于8号外显子的移码突变c.931dupC；运用PCR-Sanger测序进行突变验证及家系分析，发现患儿父母该基因位点正常(图3)。
经查询Locus Database数据库，PHEX基因的c.931dupC和IVS14+1G>A两个突变均未见报道。查阅PUBMED和CNKI及万方文献数据库许昌职称网，均无该基因突变的文献报道。
因此，本文检测到的2种PHEX基因突变为新突变。经MUTATION TASTER(www.mutationtaster.org)生物信息学分析，2例突变均为致病性突变，但未行相关基因功能学研究。
讨论
X-连锁低血磷性佝偻病(X-Linked hypophos- phatemic rickets, HYP或XLH, OMIM #307800)是低血磷性佝偻病中最常见的一种，发病率约为1/20000。XLH症状多于1岁以后症状明显，多为X-连锁显性遗传，发病机制为磷酸盐调节基因(phosphate regulating gene with homologies to endopeptidases on the X-chromosome, PHEX)突变导致血清成纤维生长因子23(FGF23)水平升高，影响肾小管对磷的重吸收，导致尿磷排泄增多、血磷水平下降。XLH早期表现为骨骼和牙不同程度的损害，如方颅、鸡胸、漏斗胸、肋骨串珠、肋外翻、手足镯，出牙延迟、易脱落、牙痛，直立行走后出现下肢骨软化症状：“X”或“O”型腿，骨骼疼痛、生长迟缓等；后期可出现牙脓肿、关节活动障碍。补充磷制剂可改善其临床症状。XLH的基因变异具有明显的异质性，多种突变形式可引起相似的临床表现。
至2016年11月，PHEX database数据库已报道444例XLH患者，共计338种PHEX基因突变，其中由中国人报道的突变共计13种。PHEX基因突变中移码突变约占27%，错义突变占21%，剪接位点突变占19%。但中国人群中最多见的PHEX基因突变类型是无义突变(约占30%)，其次为错义突变(约占22%)，剪接位点突变约占21%。本研究2例XLH患儿检测到PHEX基因突变，分别为移码突变c.931dupC和剪接位点突变IVS14+1G>A，均为国际上首次报道的新突变。在我国已报道的XLH病例中，PHEX基因突变以E18、E22外显子突变更为多见；而在PHEX数据库中，以E09、E22外显子突变较为常见。这提示PHEX基因突变呈散在分布，可能与种族、性别、地区等因素相关。
本研究先证者1的IVS14+1G>A突变位于14号内含子，何广位MUTATION TASTER(www.mutationtaster.org/)生物信息学分析提示突变“GA-A-GA”为经典的剪切位点突变方式，可影响外显子的剪切，导致外显子跳跃b型血招蚊子，产生不完整的氨基酸链，合成异常蛋白。PHEX数据库中共报道了4种类型的内含子14（I14）基因突变，其中3例为碱基缺失(IVS14,c.1584+3delGAGT;IVS14+1,c.1586+1delGA;IVS14+3,c.1586+3delGAGT)，另1例为同区域剪接位点碱基突变(IVS14-1，c.1587-1G>C)导致剪接位点异常。2012年Beck-Nielsen等报道1例31岁的女性低血磷性佝偻病患者在PHEX基因内含子14位置上发生突变：IVS14-1，c.1587-1G>C快易收口网，引起内含子保留和外显子跳跃，患者身高157 cm(-1.8 SD)，表现为轻微骨骼畸形，严重牙病变，无骨折史；血磷低，1,25(OH)2D3水平正常，PTH轻度升高，骨密度正常。
本研究先证者1发生的IVS14+1G>A突变，影响了外显子剪切，可能导致外显子15的跳跃而产生不完整的氨基酸链。本研究与Beck-Nielsen等报道的患者相比，血生化表现一致，但尚无牙病变，下肢畸形较严重，身高较正常同龄儿减低。这可能与种族、年龄或性别不同有关，也可能PHEX基因突变即使发生在同一内含子不同位置，疾病的表现在也可不一致。2013年，Yue等发现3例患儿分别在内含子I10(c.1174-1G>A)、I15(c.1646-2A>T)、I17(c.1768+2T>G)发生突变，这3例患儿均为男性，起病年龄0.75~5岁，2例有家族史、1例为散发，均有“O型腿”表现，无牙龈病变，与本研究的患儿表现一致高昌昊 。这表明基因突变的类型与表型不一定有明显的相关性。
本研究先证者2检测到PHEX基因位于8号外显子的c.931dupC移码突变：p.Gln311Profs*13，MUTATION TASTER(www.mutationtaster.org/)生物信息学分析提示，它可导致311位的氨基酸由Gln转变为Pro，在323位出现终止密码“UGA”，编码的氨基酸序列转变为P PVRLA GLHQE GH*，导致编码氨基酸提前终止、PHEX蛋白结构及功能异常，为致病性突变。该患儿骨骼畸形明显，提示移码突变产生的截短蛋白可能导致严重的表型。目前PHEX database数据库已报道6例外显子8突变(C.871C>T，c.931C>T，c.888+2G>T，c.904A>G，c.914T>C，c.897_898del)，其中5例点突变(2例错义突变、3例无义突变)，1例为缺失突变。目前PHEX数据库中尚无8号外显子插入突变的报道。
本研究2例XLH患儿检测到2个国际上首次报道的PHEX基因新突变，丰富了XLH的致病基因谱，有助于深入认识PHEX基因的异质性。
作者：冉情等
重庆医科大学附属儿童医院
摘自《中国当代儿科杂志》2017年第5期
以下是由我们实验室帮助完成的佝偻病检测一例:
先证者 1
男，3岁4个月，发现“O型腿”2年。不伴骨痛。第一胎第一产、足月顺产出生，出生时身长、体重不详，出生时无窒息。母乳喂养，10月龄添加辅食，无偏食挑食。7月龄能独坐、10月龄独站、1岁2个月能独立行走何乾梁。
既往体健。患儿父母健康，否认近亲结婚，家族中无类似患者。
体格检查
身高82 cm(-4.34 SD)，体重11 kg，前额突出，无方颅，无鸡胸，无肋骨串珠，无郝氏沟，无手足镯，心肺腹部查体未见异常，“O型腿”、膝间距9 cm避水金睛兽 。
实验室检查
血钙正常，血磷1.04 mmol/L(参考值：1.3~2.1 mmol/L)，ALP 792.8 U/L(参考值：95~405 U/L)，25(OH)D3正常，PTH正常。血气分析无异常。下肢骨片(见图1)：双膝关节骨骺端稍膨大，临时钙化带模糊。肾脏B超无异常。
先证者 2
女，7岁4个月，发现“X型腿”伴双下肢间断性疼痛5年。第一胎第一产、足月顺产出生，出生身长、体重不详，出生时无产伤、无窒息。喂养史、生长发育史无特殊。
既往体健。患儿父母体健，否认近亲结婚，家族中无类似患者。
体格检查
身高111.2 cm(-2.61 SD)猎魔通缉令，体重22.5 kg，无方颅，无鸡胸，无郝氏沟，无肋串珠，无手足镯，心肺腹部查体未见明显异常，“X型腿”、踝间距12 cm。
实验室检查
血钙正常，血磷0.5 mmol/L(参考值：1.3~2.1 mmol/L)，ALP 428 U/L(参考值：95~405 U/L)，PTH 110 pg/mL(参考值：10~69 pg/mL)。
肾脏B超：双肾皮质回声稍增强，双侧肾椎体见少许钙质成分沉着。
基因分析及家系分析
通过重庆医科大学附属儿童医院伦理审查及患儿家属知情同意后，采集患儿及其父母空腹EDTA抗凝静脉血各2 mL，提取基因组DNA。DNA浓度>10 ng/μL，体积>100 μL；纯度应达到A260/280>1.8，A260/230>1.2。
取先证者基因组，对PHEX基因的外显子区及两侧的剪接位点序列进行高通量测序，并利用PCR-Sanger测序对先证者及家系进行突变验证和分析(中国人民解放军空军医学研究所附属医院病理检验中心完成)。
引物设计根据GeneBank人类PHEX基因序列(NG_007563.2)，见表1。
PCR扩增，取PCR样品用ABI遗传分析仪进行测序。阳性突变者用另一份备用样品进行复测。
基因分析结果
经高通量捕获测序，发现先证者1在PHEX基因第14号内含子剪切位点发生单碱基置换：IVS14+1G>A；运用PCR-Sanger测序进行突变验证及家系分析克亚树，证实患儿父母该基因位点正常(图2)。
先证者2的PHEX基因检测到1个杂合突变：位于8号外显子的移码突变c.931dupC；运用PCR-Sanger测序进行突变验证及家系分析，发现患儿父母该基因位点正常(图3)。
经查询Locus Database数据库，PHEX基因的c.931dupC和IVS14+1G>A两个突变均未见报道。查阅PUBMED和CNKI及万方文献数据库许昌职称网，均无该基因突变的文献报道。
因此，本文检测到的2种PHEX基因突变为新突变。经MUTATION TASTER(www.mutationtaster.org)生物信息学分析，2例突变均为致病性突变，但未行相关基因功能学研究。
讨论
X-连锁低血磷性佝偻病(X-Linked hypophos- phatemic rickets, HYP或XLH, OMIM #307800)是低血磷性佝偻病中最常见的一种，发病率约为1/20000。XLH症状多于1岁以后症状明显，多为X-连锁显性遗传，发病机制为磷酸盐调节基因(phosphate regulating gene with homologies to endopeptidases on the X-chromosome, PHEX)突变导致血清成纤维生长因子23(FGF23)水平升高，影响肾小管对磷的重吸收，导致尿磷排泄增多、血磷水平下降。XLH早期表现为骨骼和牙不同程度的损害，如方颅、鸡胸、漏斗胸、肋骨串珠、肋外翻、手足镯，出牙延迟、易脱落、牙痛，直立行走后出现下肢骨软化症状：“X”或“O”型腿，骨骼疼痛、生长迟缓等；后期可出现牙脓肿、关节活动障碍。补充磷制剂可改善其临床症状。XLH的基因变异具有明显的异质性，多种突变形式可引起相似的临床表现。
至2016年11月，PHEX database数据库已报道444例XLH患者，共计338种PHEX基因突变，其中由中国人报道的突变共计13种。PHEX基因突变中移码突变约占27%，错义突变占21%，剪接位点突变占19%。但中国人群中最多见的PHEX基因突变类型是无义突变(约占30%)，其次为错义突变(约占22%)，剪接位点突变约占21%。本研究2例XLH患儿检测到PHEX基因突变，分别为移码突变c.931dupC和剪接位点突变IVS14+1G>A，均为国际上首次报道的新突变。在我国已报道的XLH病例中，PHEX基因突变以E18、E22外显子突变更为多见；而在PHEX数据库中，以E09、E22外显子突变较为常见。这提示PHEX基因突变呈散在分布，可能与种族、性别、地区等因素相关。
本研究先证者1的IVS14+1G>A突变位于14号内含子，何广位MUTATION TASTER(www.mutationtaster.org/)生物信息学分析提示突变“GA-A-GA”为经典的剪切位点突变方式，可影响外显子的剪切，导致外显子跳跃b型血招蚊子，产生不完整的氨基酸链，合成异常蛋白。PHEX数据库中共报道了4种类型的内含子14（I14）基因突变，其中3例为碱基缺失(IVS14,c.1584+3delGAGT;IVS14+1,c.1586+1delGA;IVS14+3,c.1586+3delGAGT)，另1例为同区域剪接位点碱基突变(IVS14-1，c.1587-1G>C)导致剪接位点异常。2012年Beck-Nielsen等报道1例31岁的女性低血磷性佝偻病患者在PHEX基因内含子14位置上发生突变：IVS14-1，c.1587-1G>C快易收口网，引起内含子保留和外显子跳跃，患者身高157 cm(-1.8 SD)，表现为轻微骨骼畸形，严重牙病变，无骨折史；血磷低，1,25(OH)2D3水平正常，PTH轻度升高，骨密度正常。
本研究先证者1发生的IVS14+1G>A突变，影响了外显子剪切，可能导致外显子15的跳跃而产生不完整的氨基酸链。本研究与Beck-Nielsen等报道的患者相比，血生化表现一致，但尚无牙病变，下肢畸形较严重，身高较正常同龄儿减低。这可能与种族、年龄或性别不同有关，也可能PHEX基因突变即使发生在同一内含子不同位置，疾病的表现在也可不一致。2013年，Yue等发现3例患儿分别在内含子I10(c.1174-1G>A)、I15(c.1646-2A>T)、I17(c.1768+2T>G)发生突变，这3例患儿均为男性，起病年龄0.75~5岁，2例有家族史、1例为散发，均有“O型腿”表现，无牙龈病变，与本研究的患儿表现一致高昌昊 。这表明基因突变的类型与表型不一定有明显的相关性。
本研究先证者2检测到PHEX基因位于8号外显子的c.931dupC移码突变：p.Gln311Profs*13，MUTATION TASTER(www.mutationtaster.org/)生物信息学分析提示，它可导致311位的氨基酸由Gln转变为Pro，在323位出现终止密码“UGA”，编码的氨基酸序列转变为P PVRLA GLHQE GH*，导致编码氨基酸提前终止、PHEX蛋白结构及功能异常，为致病性突变。该患儿骨骼畸形明显，提示移码突变产生的截短蛋白可能导致严重的表型。目前PHEX database数据库已报道6例外显子8突变(C.871C>T，c.931C>T，c.888+2G>T，c.904A>G，c.914T>C，c.897_898del)，其中5例点突变(2例错义突变、3例无义突变)，1例为缺失突变。目前PHEX数据库中尚无8号外显子插入突变的报道。
本研究2例XLH患儿检测到2个国际上首次报道的PHEX基因新突变，丰富了XLH的致病基因谱，有助于深入认识PHEX基因的异质性。
作者：冉情等
重庆医科大学附属儿童医院
摘自《中国当代儿科杂志》2017年第5期